Penyiasatan enzim mengikut prinsip Cinderella

Proses baru mempercepatkan pengasingan enzim buatan khusus dengan faktor seribu

Bakteria Fluorescent © Harald Kolmar, TU Darmstadt
membaca dengan kuat

Para saintis telah membangunkan satu proses baru yang mempercepat pengasingan enzim yang disesuaikan untuk digunakan dalam sintesis bioteknologi dan ubat oleh faktor seribu - sekurang-kurangnya. Mereka mencapai ini dengan mengasingkan bakteria penghasil enzim individu dengan penyisihan sel berkelajuan tinggi.

Enzim teknikal adalah di mana-mana hari ini. Setiap detergen mengandungi enzim yang memecah zarah kotoran. Enzim yang dioptimumkan juga diperlukan untuk menyelesaikan masalah tenaga masa depan, contohnya untuk pengeluaran biogas atau biodiesel daripada bahan mentah yang boleh diperbaharui. Bioteknologi putih memberi tumpuan kepada pengeluaran industri bahan kimia organik asas dan halus dan bahan aktif. Enzim yang dioptimumkan memainkan peranan utama. Walau bagaimanapun, alam tidak menyediakan enzim optimum untuk setiap proses sintesis kimia. Oleh itu, sering diperlukan untuk mengoptimumkan enzim semulajadi untuk aktiviti, selektiviti atau kestabilan.

Bakteria sebagai pengeluar enzim

"Selama bertahun-tahun, bakteria telah digunakan sebagai pengeluar enzim teknikal, " jelas Profesor Harald Kolmar dari Institut Kimia Organik dan Biokimia di Darmstadt Technical University (TU). "Untuk mendapatkan enzim yang dioptimumkan, prinsip asas evolusi semulajadi digunakan, iaitu mutasi dan pemilihan. Kami memperkenalkan mutasi secara rawak ke dalam gen enzim, membolehkan bakteria Escherichia coli menghasilkan varian enzim yang dihasilkan, dan kemudian mencari bakteria dengan sifat-sifat enzim yang dipertingkatkan. "

Ini telah menjadi proses yang panjang dan susah payah setakat ini. Beribu-ribu mikroorganisma, masing-masing menghasilkan varian enzim berbeza, perlu dibiakkan secara berasingan. Untuk mencapai enzim calon-calon, mikroorganisma dimusnahkan dan kandungan sel dikerjakan. "Kami menggunakan bakteria genetik dan bakteria kejuruteraan genetik untuk menjadikannya enzim pilihan bukan di dalam sel, tetapi di luar permukaan sel, " jelas Kolmar. "Kemudian sel hidup boleh digunakan secara langsung untuk ujian enzim."

Sel bercahaya

Pencapaian penting kedua telah dicapai oleh ahli sains apabila mereka berjaya meningkatkan strategi carian untuk enzim dengan sifat yang dikehendaki sehingga tahap aktiviti enzim sel bakteria individu dapat dianalisis. Untuk tujuan ini, penyelidik Darmstadt, bersama rakan sekerja di Forschungszentrum Jülich dan Institut Penyelidikan Batubara Max Planck di Mülheim, telah membangunkan satu kaedah untuk mengesan bakteria individu yang memperlihatkan enzim yang dikehendaki. paparan

Untuk tujuan ini, substrat enzim khas telah disintesis yang boleh dilabelkan dengan pewarna neon. Apabila enzim berupaya bertindak balas terhadap substrat, produk tindak balas juga ditetapkan pada permukaan sel bakteria aktif enzimatik. Oleh itu, sel-sel aktif enzimatik boleh dibezakan daripada sel-sel yang tidak aktif kerana ia membawa penanda neon dan memancarkan foton selepas pengujaan cahaya.

Banyak berjuta-juta sel bakteria, yang masing-masing membawa varian enzim yang sedikit berbeza, boleh dikenakan ujian enzim. Beberapa kemudian menunjukkan perolehan substrat dan pendarfluor. "Untuk mendapatkan bakteria berharga yang membawa enzim yang kami cari, kami menggunakan penyusun sel berkelajuan tinggi, " jelas Kolmar. Bakteria diambil di dalam air dan ditembak melalui muncung. Titisan air individu dengan bakteria terperangkap kemudian terbang melewati pancaran laser berkuasa tinggi. Sekiranya bakteria fluoresen berada dalam titisan, ia memancarkan foton dan dengan itu menunjukkan aktiviti enzim yang dikehendaki.

Prinsip Cinderella

Bakteria tersebut dikenakan secara elektrostatik, dengan itu dibelokkan dari trajektori mereka dan dikumpulkan. Bakteria non-fluoresen berakhir dalam sisa. "Kami panggil proses ini prinsip Cinderella: yang baik di dalam periuk, yang buruk di kepala. Walau bagaimanapun, kami jauh lebih cepat daripada merpati Cinderella. Seratus ribu bakteria individu dan oleh itu seratus ribu calon enzim boleh dianalisis dalam satu saat. Oleh itu, pada hari bekerja, sehingga 100 juta calon enzim ditapis. Prosedur terdahulu hanya dapat bekerja dengan beberapa ribu hingga beberapa puluhan ribu calon, kata Kolmar.

Dalam edisi seterusnya jurnal Angewandte Chemie, ahli biologi dari Darmstadt melaporkan mengenai proses ini, yang pertama kali digunakan untuk pengoptimalan enzim ester-cleaving. Dalam satu pusingan pemisahan berkelajuan tinggi 100 juta sel, ia mungkin mengasingkan varian enzim yang dikehendaki.

(idw - Technical University Darmstadt, 11.06.2008 - DLO)